摘要：比較《中國藥典》2015年版（ChP 2015）與《日本藥典》第17版（JP 17）中依達拉奉（1）注射液含量測定方法，并分別采用兩種藥典方法對日本原研及國內不同廠家生產的依達拉奉注射液進行含量測定。結果表明，日本藥典精密度優于中國藥典，但測定結果整體偏低。探究其原因，主要在于對照品溶液稀釋過程中甲醇與水表面張力不同，移取對照品溶液時產生系統誤差，導致移取體積偏大，含量結果偏低。本研究采用芬蘭Kibron EZ-Pi Plus便攜式動態表面張力儀實測了相關溶劑的表面張力，證實了該誤差的來源。針對此系統誤差，改進對照品配制方法，取消稀釋操作，采用一步到位直接配制對照品溶液，有效避免了移液誤差。改進后的方法測定結果與理論值吻合，操作更為簡便。

引言

依達拉奉（edaravone，1）注射液是日本田邊三菱制藥公司研發的自由基清除劑，于2001年4月首次在日本上市，臨床用于治療急性腦卒中。1注射液已收錄于日本藥典17版（JP 17）和《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP 2015）。

含量測定是評價藥品質量的重要手段。ChP 2015采用外標法，系統適用性試驗要求1峰與雜質I峰的分離度大于8.0；JP 17采用內標法，要求1與內標峰的分離度不小于7，且對照溶液重復進樣6次，1峰面積與內標峰面積之比的RSD不大于1.0%。內標法可避免供試品前處理及進樣體積誤差的影響。考慮到日本為原研國，且原研產品已被國家藥品監督管理局藥品審評中心選為一致性評價參比制劑，故首選JP 17方法。

本文分別采用JP 17和ChP 2015方法測定1注射液含量，發現JP 17精密度更好，但結果偏低。經分析，這是由于對照品與供試品所用溶劑不一致所致。日本藥典亦已對此進行增補修訂（JP 17 Supplement I）。本文在此基礎上提出另一改進方案，在保證結果準確的同時進一步簡化操作。

1 儀器與試劑

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UltiMate3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；Thermo BDS HYPERSIL C18鍵合硅膠柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。Kibron EZ-Pi Plus便攜式動態表面張力儀（芬蘭Kibron公司，Du Noüy–Padday桿狀探針法，測量范圍1–350 mN/m，分辨率0.001 mN/m，精度0.01 mN/m，單次樣品量0.5–3 mL，配循環水浴控溫）。

1對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量100%，批號100620-201703）；對氨基苯甲酸乙酯（內標，2，北京伊諾凱科技有限公司，含量98.0%，批號KSBJ926）；1注射液（日本原研，批號B083、C084、C085；國內廠家A，批號1712200、1804023；國內廠家B，批號180115、180212）。甲醇（色譜純，Sigma-Aldrich公司）；乙酸（分析純，北京市通廣精細化工有限公司）；氨水（分析純，北京化工廠）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 JP 17含量測定方法

2.1.1 色譜條件及系統適用性試驗  

色譜柱：C18柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相：1%乙酸-甲醇（3:1，加氨水調至pH 5.5）；流速：調整至1出峰時間約8 min；柱溫：50 ℃；檢測波長：240 nm；進樣量：2 μL。對照溶液中1與內標2峰的分離度應不小于7，對照溶液重復進樣6次，1峰面積與內標峰面積之比的RSD不得大于1.0%。

2.1.2 測定法  

精密量取1注射液2 mL，置20 mL量瓶中，精密加入0.2%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，再用甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液。取1對照品15 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，再精密加入0.2%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，用甲醇定容，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按內標法以峰面積計算，即得。

2.2 ChP 2015含量測定方法

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗  

色譜柱：C18柱；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫銨溶液（用20%磷酸溶液調至pH 3.5）-甲醇（50:50）；檢測波長：245 nm。分別取1與雜質I對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中各含0.5 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，1峰與雜質I峰的分離度應大于8.0。

2.2.2 測定法  

精密量取1注射液適量，用流動相稀釋制成每1 mL中約含150 μg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取1對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含50 μg的溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。

2.3 含量測定結果比較

按“2.1”和“2.2”項下方法分別對日本原研及國內生產的1注射液進行含量測定，結果見表1；精密度比較見表2。典型色譜圖見圖1?？梢奐P方法精密度更好，但測得結果整體偏低。

表1 樣品含量測定結果

表2 精密度結果（日本原研批號B083）

圖1 ChP 2015（A）與JP 17（B）典型色譜圖  

2.4 JP含量測定方法的合理性討論

分析JP 17含量測定方法，1對照品使用甲醇溶解并稀釋，而供試品溶液是1水溶液。由于甲醇的表面張力比水小，使用移液管移取相同體積的甲醇和水時，殘留在移液管中的甲醇溶液量比水溶液少，導致對照品實際移取體積比理論體積稍大，從而使1含量測定值偏低。

為定量確認該偏差，本研究采用芬蘭Kibron EZ-Pi Plus便攜式動態表面張力儀（25.0 ℃恒溫，Du Noüy–Padday桿狀探針法）測定相關溶劑的靜態表面張力，結果見表3。

表3 25.0 ℃下各溶劑靜態表面張力（Kibron EZ-Pi Plus測定）

甲醇表面張力僅為水的約1/3，二者相差約50 mN/m。用同一支A級移液管移取標稱2.00 mL液體時，因甲醇殘留量明顯少于水，實際放出體積偏大。在JP 17原法中，對照品溶液需“甲醇溶解→精密量取2 mL至20 mL量瓶稀釋”，該步移取的是甲醇體系，導致對照品實際濃度偏高，按內標法計算所得樣品含量偏低。該現象與表1、表2中JP 17法整體讀值較ChP 2015低約1.5%、但RSD僅0.09%的結果完全吻合。

2.5 JP含量測定方法的改進

針對上述誤差，本文提出省略對照品稀釋操作，采用直接一步到位溶解并稀釋對照品。改進后的測定方法如下：

精密量取1注射液2 mL，置20 mL量瓶中，精密加入1%的2甲醇溶液（w/v）2 mL，再用甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液；取1對照品15 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，再精密加入1%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，用甲醇定容，搖勻，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按內標法以峰面積計算，即得。

改進后的1濃度和內標濃度與原方法一致，色譜條件及系統適用性試驗不變。

2.6 改進后的測定方法結果

按“2.5”項改進方法對日本原研及國內生產的共7批1注射液進行含量測定，結果見表4。改進后含量均接近100%，與ChP 2015結果一致，且精密度良好。

表4 改進后方法樣品含量測定結果

3 討論

3.1 系統誤差原因分析

移液管標稱體積按純水校準，不同溶液因表面張力差異導致殘留量不同，從而產生系統誤差。本研究采用Kibron EZ-Pi Plus便攜式動態表面張力儀實測甲醇與水的表面張力分別為22.1和72.0 mN/m，兩者相差約50 mN/m。JP 17原法中對照品溶液移取的是甲醇體系，供試品為水體系，移液管對甲醇的實際放出體積偏大，導致對照品濃度偏高，含量結果系統性偏低。該誤差在ChP 2015外標法中因溶劑一致而不出現。

3.2 解決方案

JP 17（Supplement I）通過將供試品用甲醇稀釋至80%甲醇比例來統一溶劑，從而消除表面張力差異。本文提出的改進方法則直接取消對照品溶液的稀釋步驟，將內標溶液一次性加入含對照品的容量瓶中定容，從根本上避免了移液操作。兩種方法均可有效消除系統誤差，但本文方法操作更簡便、溶媒用量更少，可作為JP 17原法的替代方案。