摘要：比較《中國藥典》2015年版（ChP 2015）與《日本藥典》第17版（JP 17）中依達(dá)拉奉（1）注射液含量測定方法，并分別采用兩種藥典方法對日本原研及國內(nèi)不同廠家生產(chǎn)的依達(dá)拉奉注射液進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明，日本藥典精密度優(yōu)于中國藥典，但測定結(jié)果整體偏低。探究其原因，主要在于對照品溶液稀釋過程中甲醇與水表面張力不同，移取對照品溶液時(shí)產(chǎn)生系統(tǒng)誤差，導(dǎo)致移取體積偏大，含量結(jié)果偏低。本研究采用芬蘭Kibron EZ-Pi Plus便攜式動(dòng)態(tài)表面張力儀實(shí)測了相關(guān)溶劑的表面張力，證實(shí)了該誤差的來源。針對此系統(tǒng)誤差，改進(jìn)對照品配制方法，取消稀釋操作，采用一步到位直接配制對照品溶液，有效避免了移液誤差。改進(jìn)后的方法測定結(jié)果與理論值吻合，操作更為簡便。

引言

依達(dá)拉奉（edaravone，1）注射液是日本田邊三菱制藥公司研發(fā)的自由基清除劑，于2001年4月首次在日本上市，臨床用于治療急性腦卒中。1注射液已收錄于日本藥典17版（JP 17）和《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP 2015）。

含量測定是評價(jià)藥品質(zhì)量的重要手段。ChP 2015采用外標(biāo)法，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求1峰與雜質(zhì)I峰的分離度大于8.0；JP 17采用內(nèi)標(biāo)法，要求1與內(nèi)標(biāo)峰的分離度不小于7，且對照溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，1峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比的RSD不大于1.0%。內(nèi)標(biāo)法可避免供試品前處理及進(jìn)樣體積誤差的影響。考慮到日本為原研國，且原研產(chǎn)品已被國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心選為一致性評價(jià)參比制劑，故首選JP 17方法。

本文分別采用JP 17和ChP 2015方法測定1注射液含量，發(fā)現(xiàn)JP 17精密度更好，但結(jié)果偏低。經(jīng)分析，這是由于對照品與供試品所用溶劑不一致所致。日本藥典亦已對此進(jìn)行增補(bǔ)修訂（JP 17 Supplement I）。本文在此基礎(chǔ)上提出另一改進(jìn)方案，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的同時(shí)進(jìn)一步簡化操作。

1 儀器與試劑

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UltiMate3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；Thermo BDS HYPERSIL C18鍵合硅膠柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。Kibron EZ-Pi Plus便攜式動(dòng)態(tài)表面張力儀（芬蘭Kibron公司，Du Noüy–Padday桿狀探針法，測量范圍1–350 mN/m，分辨率0.001 mN/m，精度0.01 mN/m，單次樣品量0.5–3 mL，配循環(huán)水浴控溫）。

1對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量100%，批號100620-201703）；對氨基苯甲酸乙酯（內(nèi)標(biāo)，2，北京伊諾凱科技有限公司，含量98.0%，批號KSBJ926）；1注射液（日本原研，批號B083、C084、C085；國內(nèi)廠家A，批號1712200、1804023；國內(nèi)廠家B，批號180115、180212）。甲醇（色譜純，Sigma-Aldrich公司）；乙酸（分析純，北京市通廣精細(xì)化工有限公司）；氨水（分析純，北京化工廠）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 JP 17含量測定方法

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)  

色譜柱：C18柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：1%乙酸-甲醇（3:1，加氨水調(diào)至pH 5.5）；流速：調(diào)整至1出峰時(shí)間約8 min；柱溫：50 ℃；檢測波長：240 nm；進(jìn)樣量：2 μL。對照溶液中1與內(nèi)標(biāo)2峰的分離度應(yīng)不小于7，對照溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，1峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比的RSD不得大于1.0%。

2.1.2 測定法  

精密量取1注射液2 mL，置20 mL量瓶中，精密加入0.2%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，再用甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液。取1對照品15 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，再精密加入0.2%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，用甲醇定容，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.2 ChP 2015含量測定方法

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)  

色譜柱：C18柱；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫銨溶液（用20%磷酸溶液調(diào)至pH 3.5）-甲醇（50:50）；檢測波長：245 nm。分別取1與雜質(zhì)I對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中各含0.5 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，1峰與雜質(zhì)I峰的分離度應(yīng)大于8.0。

2.2.2 測定法  

精密量取1注射液適量，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中約含150 μg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取1對照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含50 μg的溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.3 含量測定結(jié)果比較

按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法分別對日本原研及國內(nèi)生產(chǎn)的1注射液進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表1；精密度比較見表2。典型色譜圖見圖1。可見JP方法精密度更好，但測得結(jié)果整體偏低。

表1 樣品含量測定結(jié)果

表2 精密度結(jié)果（日本原研批號B083）

圖1 ChP 2015（A）與JP 17（B）典型色譜圖  

2.4 JP含量測定方法的合理性討論

分析JP 17含量測定方法，1對照品使用甲醇溶解并稀釋，而供試品溶液是1水溶液。由于甲醇的表面張力比水小，使用移液管移取相同體積的甲醇和水時(shí)，殘留在移液管中的甲醇溶液量比水溶液少，導(dǎo)致對照品實(shí)際移取體積比理論體積稍大，從而使1含量測定值偏低。

為定量確認(rèn)該偏差，本研究采用芬蘭Kibron EZ-Pi Plus便攜式動(dòng)態(tài)表面張力儀（25.0 ℃恒溫，Du Noüy–Padday桿狀探針法）測定相關(guān)溶劑的靜態(tài)表面張力，結(jié)果見表3。

表3 25.0 ℃下各溶劑靜態(tài)表面張力（Kibron EZ-Pi Plus測定）

甲醇表面張力僅為水的約1/3，二者相差約50 mN/m。用同一支A級移液管移取標(biāo)稱2.00 mL液體時(shí)，因甲醇?xì)埩袅棵黠@少于水，實(shí)際放出體積偏大。在JP 17原法中，對照品溶液需“甲醇溶解→精密量取2 mL至20 mL量瓶稀釋”，該步移取的是甲醇體系，導(dǎo)致對照品實(shí)際濃度偏高，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算所得樣品含量偏低。該現(xiàn)象與表1、表2中JP 17法整體讀值較ChP 2015低約1.5%、但RSD僅0.09%的結(jié)果完全吻合。

2.5 JP含量測定方法的改進(jìn)

針對上述誤差，本文提出省略對照品稀釋操作，采用直接一步到位溶解并稀釋對照品。改進(jìn)后的測定方法如下：

精密量取1注射液2 mL，置20 mL量瓶中，精密加入1%的2甲醇溶液（w/v）2 mL，再用甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液；取1對照品15 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，再精密加入1%的2甲醇溶液（w/v）10 mL，用甲醇定容，搖勻，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

改進(jìn)后的1濃度和內(nèi)標(biāo)濃度與原方法一致，色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)不變。

2.6 改進(jìn)后的測定方法結(jié)果

按“2.5”項(xiàng)改進(jìn)方法對日本原研及國內(nèi)生產(chǎn)的共7批1注射液進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表4。改進(jìn)后含量均接近100%，與ChP 2015結(jié)果一致，且精密度良好。

表4 改進(jìn)后方法樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 系統(tǒng)誤差原因分析

移液管標(biāo)稱體積按純水校準(zhǔn)，不同溶液因表面張力差異導(dǎo)致殘留量不同，從而產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。本研究采用Kibron EZ-Pi Plus便攜式動(dòng)態(tài)表面張力儀實(shí)測甲醇與水的表面張力分別為22.1和72.0 mN/m，兩者相差約50 mN/m。JP 17原法中對照品溶液移取的是甲醇體系，供試品為水體系，移液管對甲醇的實(shí)際放出體積偏大，導(dǎo)致對照品濃度偏高，含量結(jié)果系統(tǒng)性偏低。該誤差在ChP 2015外標(biāo)法中因溶劑一致而不出現(xiàn)。

3.2 解決方案

JP 17（Supplement I）通過將供試品用甲醇稀釋至80%甲醇比例來統(tǒng)一溶劑，從而消除表面張力差異。本文提出的改進(jìn)方法則直接取消對照品溶液的稀釋步驟，將內(nèi)標(biāo)溶液一次性加入含對照品的容量瓶中定容，從根本上避免了移液操作。兩種方法均可有效消除系統(tǒng)誤差，但本文方法操作更簡便、溶媒用量更少，可作為JP 17原法的替代方案。