一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
1. 建立Kibron儀器在35%高鹽條件下的表面張力標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試流程，規(guī)避高鹽體系鹽析結(jié)晶、基線漂移、鹽離子本底干擾問(wèn)題。
2. 測(cè)定海洋耐鹽菌發(fā)酵液動(dòng)態(tài)表面張力，評(píng)價(jià)菌株在高鹽環(huán)境下產(chǎn)生物表面活性劑的能力。
3. 通過(guò)高鹽基質(zhì)空白校正，扣除35%鹽溶液本身帶來(lái)的表面張力變化，區(qū)分鹽離子效應(yīng)和微生物代謝產(chǎn)物的界面效應(yīng)。
4. 形成可復(fù)現(xiàn)的高鹽微生物發(fā)酵液界面表征方法，用于極端耐鹽菌株的篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化。
二、儀器材料與試劑準(zhǔn)備
1. 儀器
芬蘭Kibron表面張力儀，EZ?Pi Plus單通道或者Delta?8高通量機(jī)型，配備DyneProbe鉑銥探針，溫控樣品臺(tái)，配套Kibron分析軟件。高速離心機(jī)，真空脫氣裝置，pH計(jì)，超純水機(jī)。
2. 試劑與樣品
海洋耐鹽菌發(fā)酵液，氯化鈉，配置35%(w/v)高鹽基質(zhì)溶液。35%高鹽空白基質(zhì)，除不接種菌株以外，其余培養(yǎng)基組分、鹽濃度、pH與發(fā)酵體系完全一致。全部溶液配制完成后真空脫氣10?15min，除去溶解氣體。
3. 耗材
PTFE材質(zhì)樣品杯，優(yōu)先選用貨號(hào)3640，耐高鹽腐蝕；96孔測(cè)試選用耐鹽DynePlate微孔板，低吸附離心管，無(wú)水乙醇，0.22μm水系濾膜，濾膜提前用35%高鹽基質(zhì)潤(rùn)洗，降低濾膜對(duì)表活物質(zhì)的吸附損失。
4. 儀器校驗(yàn)準(zhǔn)備
儀器放置在無(wú)震動(dòng)、無(wú)空調(diào)直吹的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，整機(jī)通電預(yù)熱60min，關(guān)閉防風(fēng)罩。鉑銥探針依次超純水沖洗，無(wú)水乙醇沖洗，高純氮?dú)獯蹈伞Ｊ紫扔?5℃超純水做基礎(chǔ)張力校準(zhǔn)，純水表面張力穩(wěn)定72.0?72.8mN/m，通道偏差小于0.2mN/m，確認(rèn)儀器硬件基線正常。測(cè)試溫度固定25.0±0.5℃。
高鹽體系不要直接用高鹽溶液做儀器硬件零點(diǎn)標(biāo)定，硬件標(biāo)定統(tǒng)一使用超純水，高鹽的本底效應(yīng)依靠后續(xù)基質(zhì)空白進(jìn)行校正。
三、樣品與高鹽空白基質(zhì)制備
1. 菌株培養(yǎng)取樣。海洋耐鹽菌在35%鹽濃度培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，設(shè)置對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速，設(shè)置3份生物學(xué)平行。分別在0h、24h、48h、72h等時(shí)間節(jié)點(diǎn)取樣。
2. 樣品預(yù)處理。取得的發(fā)酵菌液8000g離心20min，去除菌體沉淀，吸取上清。上清液經(jīng)過(guò)預(yù)先潤(rùn)洗的0.22μm濾膜過(guò)濾，去除殘留菌體與顆粒雜質(zhì)，得到澄清發(fā)酵上清液。過(guò)濾操作輕柔，禁止劇烈震蕩，避免產(chǎn)生氣泡。
3. 35%高鹽空白基質(zhì)制備。按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方，配制不含菌株的35%鹽空白培養(yǎng)基，和實(shí)驗(yàn)組同步搖床孵育相同時(shí)間，經(jīng)過(guò)同樣離心、過(guò)濾操作，得到高鹽基質(zhì)空白溶液。用于扣除鹽離子、培養(yǎng)基組分帶來(lái)的本底張力。
4. 樣品平衡處理。過(guò)濾后的發(fā)酵上清與高鹽空白基質(zhì)，室溫靜置平衡30min，目視檢查無(wú)結(jié)晶析出、無(wú)氣泡。35%鹽體系溶解度有限，低溫容易析出鹽結(jié)晶，樣品全程避免降溫。樣品現(xiàn)配現(xiàn)測(cè)，4℃存放會(huì)析出氯化鈉晶體，禁止冷藏保存。
四、Kibron上機(jī)完整操作流程
1. 軟件參數(shù)設(shè)置。新建動(dòng)態(tài)表面張力時(shí)間掃描程序，測(cè)試溫度25℃，總采集時(shí)間設(shè)置90?120min，保證表面張力達(dá)到穩(wěn)定平臺(tái)。采集間隔2?5秒每數(shù)據(jù)點(diǎn)，探針下降速度2mm/min，探針浸入液面深度0.3mm。每個(gè)樣品設(shè)置2次技術(shù)重復(fù)。
2. 上樣操作，單通道PTFE樣品杯模式。沿杯壁緩慢加入150?200μL待測(cè)樣品，動(dòng)作平緩，不能沖擊液面，防止產(chǎn)生氣泡。將樣品杯放置溫控樣品臺(tái)，關(guān)閉防風(fēng)罩靜置8?10min，消除移液擾動(dòng)，等待液面穩(wěn)定。探針下降接觸氣液界面，啟動(dòng)采集，記錄完整動(dòng)態(tài)張力?時(shí)間曲線。
如果使用Delta?8高通量96孔板模式，每孔加入50μL樣品，檢查孔內(nèi)無(wú)氣泡、無(wú)鹽結(jié)晶，將微孔板卡緊固定，空白基質(zhì)和待測(cè)樣品排布于同一塊板，啟動(dòng)批量自動(dòng)測(cè)試。
3. 高鹽樣品之間探針清洗流程。35%高鹽溶液極易在探針表面蒸發(fā)析出鹽結(jié)晶，鹽晶會(huì)造成讀數(shù)嚴(yán)重失真。每完成一個(gè)高鹽樣品測(cè)試，探針使用大量超純水沖洗5次，充分溶解探針表面附著鹽分，再用無(wú)水乙醇沖洗，高純氮?dú)獯蹈伞y(cè)試完高鹽樣品后，增加一步純水30min浸泡清洗，去除探針縫隙殘留鹽分。
4. 測(cè)試順序安排。先測(cè)試超純水基線空白，再測(cè)試同批次35%高鹽基質(zhì)空白，之后測(cè)試各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的耐鹽菌發(fā)酵上清樣品。全部樣品測(cè)試結(jié)束后，再次復(fù)測(cè)超純水，確認(rèn)探針沒(méi)有鹽殘留污染。復(fù)測(cè)純水張力偏差大于0.2mN/m，說(shuō)明探針殘留鹽分，本組全部數(shù)據(jù)作廢，探針重新深度清洗復(fù)測(cè)。
五、數(shù)據(jù)處理與空白校正步驟
1. 導(dǎo)出全部原始動(dòng)態(tài)張力數(shù)據(jù)，查看首尾兩次超純水基線，確認(rèn)探針沒(méi)有鹽結(jié)晶污染。基線漂移超過(guò)0.2mN/m，需要重新清洗探針再實(shí)驗(yàn)。
2. 獲取35%高鹽基質(zhì)空白完整動(dòng)態(tài)張力曲線，該曲線包含高鹽本身、培養(yǎng)基組分帶來(lái)的表面張力變化，不可以使用純水做扣除。
3. 將發(fā)酵上清原始張力曲線，減去同批次35%高鹽基質(zhì)空白曲線，得到校正后的動(dòng)態(tài)表面張力曲線。校正后得到的張力下降才是微生物代謝生物表面活性劑帶來(lái)的真實(shí)界面效應(yīng)。
4. 提取校正之后的關(guān)鍵參數(shù)，初始表面張力，平衡表面張力，張力下降速率。統(tǒng)計(jì)生物學(xué)平行與技術(shù)平行的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
5. 對(duì)比不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)校正后的張力變化，評(píng)價(jià)耐鹽菌株在35%高鹽條件下產(chǎn)表活能力。同時(shí)記錄樣品pH，作為輔助參考指標(biāo)。
六、關(guān)鍵細(xì)節(jié)與質(zhì)量控制
1. 35%氯化鈉體系溶解度有限，樣品溫度降低會(huì)析出鹽晶體，樣品、樣品杯、探針都不能遇冷，全程室溫操作，禁止冷藏樣品。一旦出現(xiàn)鹽結(jié)晶，該樣品直接作廢。
2. 鹽會(huì)隨溶劑揮發(fā)在探針表面結(jié)晶，探針清洗步驟必須嚴(yán)格執(zhí)行，高鹽樣品不能多個(gè)連續(xù)測(cè)試不清洗探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)束探針必須純水充分浸泡沖洗，去除縫隙內(nèi)殘留鹽。
3. 不能用純水代替35%高鹽基質(zhì)空白進(jìn)行數(shù)據(jù)扣除。高濃度鹽離子本身會(huì)改變水溶液表面張力，直接用純水扣會(huì)造成結(jié)果嚴(yán)重虛高。
4. 濾膜必須提前用35%高鹽基質(zhì)潤(rùn)洗，避免濾膜吸附生物表面活性劑，造成測(cè)得張力變化偏小。
5. 全程嚴(yán)防氣泡，高鹽溶液粘度變化，微小氣泡不容易消散，氣泡會(huì)帶來(lái)曲線劇烈抖動(dòng)，出現(xiàn)震蕩曲線優(yōu)先排查氣泡問(wèn)題，重新制樣。
6. 環(huán)境溫度波動(dòng)控制±1℃以?xún)?nèi)，溫度變化既影響鹽溶解度，也會(huì)改變表面張力讀數(shù)。
7. 不建議長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)動(dòng)態(tài)采集超過(guò)120min，長(zhǎng)時(shí)間測(cè)試液面溶劑揮發(fā)，鹽濃度會(huì)進(jìn)一步升高，帶來(lái)持續(xù)漂移，如需更長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)，需要評(píng)估揮發(fā)帶來(lái)的誤差。
