一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
1. 使用Kibron表面張力儀測定不同配方基因遞送脂質(zhì)納米粒的臨界膠束濃度CMC。
2. 完成對應(yīng)批次脂質(zhì)納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，定量檢測轉(zhuǎn)染效率。
3. 分析CMC大小與轉(zhuǎn)染效率之間的相關(guān)性，探究界面膠束形成行為對基因遞送效果的影響，篩選界面性質(zhì)適配的脂質(zhì)納米粒處方。
4. 建立一套可重復(fù)的界面參數(shù)?細(xì)胞功能關(guān)聯(lián)評價(jià)實(shí)驗(yàn)流程。
二、儀器、材料與試劑準(zhǔn)備
1. 儀器
芬蘭Kibron表面張力儀，可選EZ?Pi Plus或者Delta?8高通量型號，配備鉑銥金屬探針，溫控樣品臺，配套Kibron分析軟件。超純水機(jī)，0.22μm水系有機(jī)系濾器，高速離心機(jī)，渦旋儀，細(xì)胞培養(yǎng)箱，熒光酶標(biāo)儀或者流式細(xì)胞儀，pH計(jì)。
2. 試劑與樣品
多組不同處方基因遞送脂質(zhì)納米粒LNP儲備液，包含不同可電離脂質(zhì)比例、輔助脂質(zhì)比例的配方，LNP包裹核酸（mRNA/siRNA）。LNP稀釋介質(zhì)，一般為無血清培養(yǎng)基或者PBS緩沖液，根據(jù)體內(nèi)外應(yīng)用場景確定。細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，胎牛血清，轉(zhuǎn)染用細(xì)胞，核酸表達(dá)檢測相關(guān)試劑。全部緩沖液提前真空脫氣10?15min，0.22μm過濾除去雜質(zhì)和微氣泡。
3. 耗材
低吸附離心管，石英樣品杯或者Kibron專用96孔微孔板，無水乙醇，移液槍低吸附槍頭。
4. 儀器校驗(yàn)準(zhǔn)備
儀器放置于無震動(dòng)、避開直吹氣流的實(shí)驗(yàn)臺面，整機(jī)通電預(yù)熱60min，全程關(guān)閉防風(fēng)罩。鉑銥探針依次超純水沖洗，無水乙醇沖洗，高純氮?dú)獯蹈伞Ｊ褂?5℃超純水做張力校準(zhǔn)，純水表面張力穩(wěn)定72.0?72.8mN/m，通道之間偏差小于0.2mN/m，確認(rèn)基線穩(wěn)定后，方可開展樣品測試。測試溫度固定25.0±0.5℃。
三、脂質(zhì)納米粒樣品梯度稀釋制備
1. 確定濃度梯度范圍。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置足夠?qū)挐舛葏^(qū)間，覆蓋遠(yuǎn)低于CMC到遠(yuǎn)高于CMC區(qū)間，設(shè)置12?16個(gè)濃度梯度點(diǎn)。高濃度端從LNP母液開始，逐級2倍梯度稀釋。梯度稀釋介質(zhì)必須和后續(xù)測試介質(zhì)完全統(tǒng)一。
2. 稀釋操作全部使用低吸附離心管，移液操作輕柔，避免劇烈渦旋產(chǎn)生氣泡。每一個(gè)稀釋點(diǎn)充分顛倒混勻，禁止高速震蕩。配好的梯度樣品室溫靜置平衡30min，讓脂質(zhì)膠束充分完成界面平衡。
3. 每個(gè)濃度梯度設(shè)置2份平行樣品。同步準(zhǔn)備空白稀釋介質(zhì)對照組，用于后續(xù)基線扣除。所有樣品目視檢查，無可見沉淀、無氣泡，出現(xiàn)氣泡的樣品需要重新配制。
四、Kibron動(dòng)態(tài)表面張力測定CMC操作流程
1. 軟件參數(shù)設(shè)置。新建靜態(tài)/動(dòng)態(tài)表面張力測試程序，選擇時(shí)間掃描模式，測試溫度25℃。每個(gè)濃度樣品采集時(shí)間設(shè)置30?60min，保證表面張力達(dá)到平衡。采集間隔2?5秒每點(diǎn)，探針浸入深度控制0.3mm，探針下降速度2mm/min。
2. 單通道石英杯上樣。取150?200μL樣品，沿著杯壁緩慢加入石英樣品杯，避免沖擊液面產(chǎn)生氣泡。將樣品杯放置溫控臺，關(guān)閉防風(fēng)罩靜置5min，消除上樣擾動(dòng)。控制探針下降接觸氣液界面，啟動(dòng)采集，等待張力數(shù)值完全穩(wěn)定，記錄平衡表面張力。
如果使用Delta?8高通量96孔板模式，每孔加入50μL梯度樣品，小心避免產(chǎn)生氣泡，微孔板放置靜置30min，檢查孔內(nèi)氣泡，有氣泡孔舍棄，將微孔板固定卡槽，啟動(dòng)批量自動(dòng)測試。
3. 樣品間探針清洗流程。每完成一個(gè)濃度點(diǎn)測試，探針超純水沖洗3次，無水乙醇沖洗，氮?dú)獯蹈桑龠M(jìn)行下一樣品，防止脂質(zhì)吸附殘留造成交叉污染。
4. 所有梯度濃度全部完成測試，同步完成空白介質(zhì)測試，導(dǎo)出全部平衡表面張力原始數(shù)據(jù)。
五、細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染效率測定
1. 使用同一批次，同一稀釋介質(zhì)的LNP樣品，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞提前鋪板，細(xì)胞匯合度控制在合適范圍，按照實(shí)驗(yàn)方案設(shè)置復(fù)孔，每個(gè)LNP配方設(shè)置3個(gè)生物學(xué)復(fù)孔。
2. LNP按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定的給藥濃度加到細(xì)胞孔板，按照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程孵育培養(yǎng)。孵育結(jié)束后，按照檢測方案處理細(xì)胞。
3. 轉(zhuǎn)染效率檢測，若是熒光報(bào)告基因，使用流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞比例，或者酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度；非熒光核酸可以采用qPCR、蛋白免疫印跡等手段定量核酸表達(dá)水平。記錄每個(gè)配方的轉(zhuǎn)染效率數(shù)值，同時(shí)記錄細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)作為輔助參考。
六、數(shù)據(jù)處理與CMC?轉(zhuǎn)染效率關(guān)聯(lián)分析
1. 將Kibron導(dǎo)出的原始數(shù)據(jù)，扣除空白介質(zhì)基線，提取每個(gè)LNP濃度對應(yīng)的平衡表面張力。以脂質(zhì)總濃度為X軸，平衡表面張力為Y軸繪制曲線。
2. 曲線會(huì)出現(xiàn)兩段折線，高濃度區(qū)間表面張力不再明顯下降，兩段直線交點(diǎn)對應(yīng)的濃度即為CMC臨界膠束濃度。每個(gè)配方平行樣計(jì)算CMC平均值以及偏差。
3. 將各個(gè)LNP配方得到的CMC數(shù)值，與對應(yīng)批次測得的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配。繪制CMC?轉(zhuǎn)染效率散點(diǎn)圖，進(jìn)行相關(guān)性分析。
4. 結(jié)果判斷邏輯。CMC數(shù)值高低代表脂質(zhì)形成膠束的能力。CMC偏低代表脂質(zhì)更容易形成膠束；CMC過高，脂質(zhì)不容易形成膠束，游離脂質(zhì)占比高，可能帶來細(xì)胞毒性，影響轉(zhuǎn)染。對比不同處方，判斷是低CMC對應(yīng)更高轉(zhuǎn)染效率，還是存在最優(yōu)CMC窗口。
5. 同步記錄LNP理化表征，粒徑、Zeta電位、包封率，輔助解釋CMC與轉(zhuǎn)染效率之間的變化關(guān)系，區(qū)分是CMC本身帶來的效應(yīng)還是粒徑包封率干擾。
七、關(guān)鍵細(xì)節(jié)與質(zhì)量控制
1. 梯度稀釋介質(zhì)必須統(tǒng)一，pH、離子強(qiáng)度嚴(yán)格保持一致，緩沖體系變化會(huì)直接改變CMC測定結(jié)果。
2. 脂質(zhì)極易吸附在金屬探針表面，探針清洗步驟不可省略，高濃度LNP測試結(jié)束后，必要時(shí)乙醇浸泡探針去除脂質(zhì)殘留。
3. 氣泡會(huì)嚴(yán)重干擾表面張力讀數(shù)，配樣、上樣全程嚴(yán)防氣泡，出現(xiàn)氣泡必須重新制備樣品。
4. CMC測試和細(xì)胞轉(zhuǎn)染必須使用同一批次LNP，間隔時(shí)間盡量縮短，避免LNP儲存降解、粒徑變化，造成兩組數(shù)據(jù)不匹配。
5. LNP樣品避免強(qiáng)光長時(shí)間照射，防止脂質(zhì)氧化降解。
6. 環(huán)境溫度波動(dòng)控制±1℃以內(nèi)，溫度會(huì)改變CMC與表面張力結(jié)果。
