一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
從受重金屬污染土壤分離得到多株修復(fù)功能微生物，開展液體搖瓶發(fā)酵；借助芬蘭Kibron界面張力檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)酵上清液氣?液表面張力、油水界面張力以及動(dòng)態(tài)吸附曲線，定量對(duì)比不同菌株分泌生物表面活性劑的性能。依靠界面動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，篩選出產(chǎn)表活能力優(yōu)秀的菌株，探究環(huán)境條件對(duì)于胞外活性代謝產(chǎn)物的影響，為重金屬淋溶修復(fù)菌種篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化提供量化檢測(cè)手段。
二、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備
1.儀器與耗材準(zhǔn)備
核心儀器選用Kibron?Epsilon動(dòng)態(tài)界面張力儀，用來采集發(fā)酵上清動(dòng)態(tài)表面張力曲線；Delta?8高通量張力分析儀用于大批量菌株樣品快速篩查。配套Wilhelmy合金探針、帕爾貼恒溫基座、石英微量樣品杯、低吸附96孔微孔板、探針火焰灼燒清潔組件、儀器配套的數(shù)據(jù)采集軟件。
輔助設(shè)備包含超凈工作臺(tái)、恒溫振蕩搖床、高速冷凍離心機(jī)、pH檢測(cè)儀、超聲波清洗儀、無菌離心管、重金屬污染土壤浸出培養(yǎng)液、濾器。
實(shí)驗(yàn)耗材為多株土壤重金屬修復(fù)功能菌、基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基、重金屬離子母液、磷酸鹽緩沖液、酸堿調(diào)節(jié)劑、超純水、無水乙醇、異丙醇。
2.儀器預(yù)處理規(guī)范
設(shè)備提前通電預(yù)熱三十分鐘，檢測(cè)溫度設(shè)置為菌株最適培養(yǎng)溫度，溫控保持穩(wěn)定。
每一次測(cè)試之前使用明火灼燒金屬探針，燒掉探針表面粘附的多糖、脂肽類胞外殘留物，探針冷卻之后進(jìn)行純水基線校準(zhǔn)。等到純水表面張力長時(shí)間穩(wěn)定，基線沒有明顯浮動(dòng)之后，方可開始樣品檢測(cè)。
樣品杯、微孔板依次使用異丙醇、無水乙醇、超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈伞２僮鬟^程手部不要觸碰容器內(nèi)側(cè)，皮膚油脂會(huì)干擾氣?液界面。儀器放置在減震臺(tái)面，關(guān)閉防風(fēng)防護(hù)罩，避免空氣流動(dòng)擾動(dòng)液面以及加速水分蒸發(fā)。
3.實(shí)驗(yàn)組搭建以及發(fā)酵上清預(yù)處理
首先將所有待篩選的功能菌株在固體培養(yǎng)基傳代活化，挑取單菌落制備菌懸液。
設(shè)置搖瓶實(shí)驗(yàn)組，分為空白對(duì)照組、單一菌株發(fā)酵組；還可以添加不同重金屬濃度、酸堿度、溫度的變量組別，探究脅迫環(huán)境對(duì)菌株產(chǎn)表活的影響，每一組準(zhǔn)備三組平行搖瓶。
所有搖瓶保持一致的轉(zhuǎn)速、溫度與培養(yǎng)時(shí)長。培養(yǎng)結(jié)束之后取出菌液，使用高速離心機(jī)分離菌體沉淀，吸取上層澄清發(fā)酵液。
上清液肉眼可見細(xì)小菌體碎屑時(shí)選用低吸附水系濾膜緩慢過濾；液體通透干凈就跳過過濾步驟，防止疏水型生物表面活性劑被濾膜吸附損耗。
發(fā)酵上清輕柔顛倒混勻，低溫低速超聲脫氣，除去溶液內(nèi)部微小氣泡，氣泡會(huì)消耗界面活性分子，干擾后續(xù)張力檢測(cè)結(jié)果，樣品做到現(xiàn)處理現(xiàn)測(cè)試。
4.預(yù)實(shí)驗(yàn)基線驗(yàn)證
空白發(fā)酵培養(yǎng)液上機(jī)開展動(dòng)態(tài)表面張力測(cè)試，確認(rèn)空白培養(yǎng)基本身不會(huì)降低水相表面張力。選取其中一株菌株的發(fā)酵上清進(jìn)行預(yù)檢測(cè)，確認(rèn)探針潤濕狀態(tài)正常，儀器可以捕捉表面活性劑造成的張力下降曲線。
三、標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)檢測(cè)完整操作流程
1.Kibron?Epsilon動(dòng)態(tài)表面張力精細(xì)檢測(cè)流程
吸取一百五十微升脫氣完畢的發(fā)酵上清，沿著石英樣品杯杯壁緩慢倒入，液面內(nèi)部不能出現(xiàn)氣泡。
樣品杯放置恒溫基座，閉合防風(fēng)罩靜置十分鐘，液面溫度和氣?液界面達(dá)到穩(wěn)定。
開啟張力采集程序，持續(xù)采集一百二十分鐘的時(shí)間?動(dòng)態(tài)表面張力曲線，完整記錄活性物質(zhì)向界面吸附全過程的數(shù)據(jù)。
樣品檢測(cè)結(jié)束之后升起探針，火焰灼燒清理附著物，倒掉廢液、清洗晾干樣品杯。檢測(cè)順序依照菌株樣品從預(yù)估低活性至高活性依次進(jìn)行，規(guī)避高濃度表活殘留污染后續(xù)樣品。
如果需要評(píng)估活性劑對(duì)于疏水重金屬附著物的潤濕能力，可以繼續(xù)開展油水界面張力測(cè)試。
2.Delta?8高通量批量菌株篩查流程
各個(gè)菌株發(fā)酵上清添加至96孔低吸附微孔板，微孔板加蓋之后恒溫靜置平衡。
啟動(dòng)儀器自動(dòng)檢測(cè)程序，每一個(gè)檢測(cè)孔重復(fù)檢測(cè)三次，取平均值當(dāng)作最終檢測(cè)數(shù)值。批次檢測(cè)期間每隔十個(gè)樣品放入空白培養(yǎng)基對(duì)照孔，隨時(shí)監(jiān)控儀器基線漂移。
3.菌株產(chǎn)表活能力配套輔助試驗(yàn)
留存各組發(fā)酵上清，記錄發(fā)酵液pH、菌體生物量；后續(xù)可開展重金屬淋溶試驗(yàn)，對(duì)照菌株表活指標(biāo)和重金屬洗脫效果之間的聯(lián)系。
4.平行樣品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
同一菌株三份平行上清測(cè)得平衡表面張力差值偏大的時(shí)候，樣品需要重新離心脫氣復(fù)測(cè)。全部樣品的檢測(cè)溫度、靜置時(shí)長、探針下落參數(shù)保持統(tǒng)一，保障不同菌株的數(shù)據(jù)具備可比性。
5.實(shí)驗(yàn)收尾和儀器養(yǎng)護(hù)
全部樣品測(cè)試結(jié)束之后反復(fù)灼燒探針，清除頑固的胞外聚合物殘留；所有容器經(jīng)過乙醇浸泡沖洗、晾干存放。導(dǎo)出每一株菌株的靜態(tài)張力數(shù)值、動(dòng)態(tài)吸附曲線數(shù)據(jù)，探針放置干燥防塵環(huán)境保存。
四、基于Kibron檢測(cè)數(shù)據(jù)的定量評(píng)價(jià)方法
1.從動(dòng)態(tài)張力曲線提取定量參數(shù)
吸附誘導(dǎo)時(shí)長，代表菌株代謝出來的活性分子遷移抵達(dá)氣液界面所需時(shí)間。
表面張力下降速率，用來表征活性分子的界面擴(kuò)散速度。
平衡表面張力，界面吸附飽和之后穩(wěn)定的最低張力數(shù)值，該數(shù)值越低代表產(chǎn)表活性能越強(qiáng)。
達(dá)到界面吸附平衡消耗的時(shí)長。
2.分級(jí)定量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
對(duì)比空白培養(yǎng)基的表面張力，計(jì)算每一份發(fā)酵上清的張力下降幅度。
按照平衡表面張力劃分等級(jí)，張力下降幅度越高，菌株分泌生物表面活性劑能力越強(qiáng)；再結(jié)合吸附動(dòng)力學(xué)速度，綜合評(píng)判活性劑分子鋪展效率。
對(duì)比不同重金屬脅迫組別張力參數(shù)變化，判斷重金屬脅迫是否能夠刺激功能菌分泌更多胞外活性物質(zhì)。
結(jié)合菌體生長量，計(jì)算單位菌體產(chǎn)出的表活界面活性，消除菌體生物量差異帶來的干擾，客觀對(duì)比菌株產(chǎn)表活水平。
3.篩選和條件優(yōu)化
優(yōu)先挑選平衡表面張力低、界面吸附速度快的優(yōu)勢(shì)菌株。依托多組環(huán)境變量試驗(yàn)，確定能夠刺激菌株高效合成表面活性劑的溫度、酸堿度、重金屬濃度條件。
五、關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)控制要點(diǎn)
1.發(fā)酵上清含有黏性EPS和脂肽殘留物，每次檢測(cè)之后探針必須灼燒清理干凈，防止殘留物干擾后續(xù)樣品。
2.嚴(yán)格把控檢測(cè)溫度，溫度改變活性分子擴(kuò)散速率以及膠束形態(tài)，容易造成評(píng)價(jià)偏差。
3.待測(cè)上清一定要脫除微氣泡，殘留氣泡會(huì)消耗活性單體，動(dòng)態(tài)張力檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)誤差。
4.上清液清澈就不要過濾，疏水類生物表面活性劑很容易吸附在濾膜表層，低估菌株產(chǎn)表活能力。
5.所有菌株的搖瓶培養(yǎng)條件統(tǒng)一，菌體生長情況的差異需要單獨(dú)校正，保證評(píng)價(jià)結(jié)果只來源于產(chǎn)表活能力區(qū)別。
6.檢測(cè)全程關(guān)閉防風(fēng)罩，氣流吹動(dòng)液面會(huì)破壞氣?液界面，造成動(dòng)態(tài)張力曲線波動(dòng)。
