一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

乳酸菌在液態(tài)長時間發(fā)酵過程當(dāng)中逐步合成、分泌脂肽類生物表面活性劑；本方案采用芬蘭Kibron?Epsilon動態(tài)界面張力儀，分時段取樣檢測發(fā)酵上清動態(tài)表面張力，完整監(jiān)測全發(fā)酵周期脂肽的合成、累積、峰值、后期降解全過程，耦合乳酸菌菌體生長狀態(tài)，確定脂肽產(chǎn)出的關(guān)鍵時間段、最佳收獲時間；同時解析脂肽分子向氣?液界面的吸附動力學(xué)特征，為乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化提供界面活性數(shù)據(jù)支撐。

二、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備

1.儀器與耗材準(zhǔn)備

核心檢測儀器：Kibron?Epsilon動態(tài)界面張力儀用于樣品動態(tài)張力曲線精細(xì)測定；Kibron Delta?8高通量張力分析儀負(fù)責(zé)大批量時序樣品快速篩查；配套Wilhelmy合金探針、帕爾貼恒溫樣品基座、石英微量樣品杯、低吸附96孔微孔板、丁烷探針灼燒清潔組件、儀器專用數(shù)據(jù)采集軟件。

輔助設(shè)備：超凈工作臺、恒溫振蕩搖床、Bioscreen微生物生長曲線儀、高速冷凍離心機(jī)、pH計、低吸附0.22 μm水系濾膜、水浴恒溫箱、超聲清洗機(jī)、無菌離心管、無菌取樣管。

實(shí)驗(yàn)耗材：目標(biāo)產(chǎn)脂肽乳酸菌菌株、乳酸菌專用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、酸堿調(diào)節(jié)劑、去離子純水、無水乙醇、異丙醇。

2.儀器預(yù)處理規(guī)范

1. Kibron張力儀提前通電預(yù)熱30 min，檢測溫控設(shè)置為乳酸菌發(fā)酵溫度37 ℃，全程溫度恒定，溫度浮動控制在±0.2 ℃以內(nèi)。

2. Wilhelmy合金探針每次檢測之前使用丁烷火焰充分灼燒，燒掉探針表面附著的脂肽、胞外多糖、發(fā)酵殘渣；探針冷卻恒溫之后執(zhí)行純水零點(diǎn)校準(zhǔn)；純水的平衡表面張力穩(wěn)定維持71.8~72.2 mN/m，基線連續(xù)30 min波動小于0.2 mN/m才可開始檢測。

3. 石英樣品杯、微孔板依次異丙醇擦拭、無水乙醇沖洗、超純水多次潤洗，氮?dú)獯蹈?；操作過程手指禁止觸碰容器內(nèi)壁，油脂雜質(zhì)會嚴(yán)重干擾氣?液界面。儀器放置減震臺面，閉合防風(fēng)防護(hù)罩，規(guī)避氣流擾動以及水分蒸發(fā)造成發(fā)酵上清濃縮。

3.乳酸菌發(fā)酵搭建、周期取樣規(guī)劃以及上清預(yù)處理

1. 菌種活化：將乳酸菌劃線傳代活化，制備標(biāo)準(zhǔn)化菌懸液，統(tǒng)一初始菌體OD數(shù)值。

2. 搖瓶發(fā)酵：實(shí)驗(yàn)組搖瓶接入菌液；空白對照組裝入未接種乳酸菌的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基；每組設(shè)置3組生物學(xué)平行搖瓶；搖床溫度37 ℃、固定轉(zhuǎn)速開展長時間連續(xù)發(fā)酵。

3. 時序取樣：依據(jù)乳酸菌完整生長周期設(shè)定總發(fā)酵時長，每間隔2 h無菌快速取樣；取樣時縮短搖瓶開蓋時長，降低雜菌污染風(fēng)險；同步可使用Bioscreen儀器監(jiān)測菌體OD600生長曲線。

4. 發(fā)酵上清預(yù)處理

（1）取出采集的乳酸菌菌液，8000 r/min常溫離心15 min，沉降乳酸菌菌體、沉淀雜質(zhì)，吸取上層澄清發(fā)酵上清；

（2）上清液含有細(xì)微菌體碎屑時選用低吸附水系濾膜緩慢過濾；液體清澈通透直接跳過過濾，脂肽屬于疏水活性物質(zhì)極易吸附在普通濾膜造成樣品損耗；

（3）待測上清水浴恒溫至37 ℃，低功率超聲脫氣6?8 min，去除溶液內(nèi)部微小氣泡，超聲功率不可過高，防止脂肽結(jié)構(gòu)遭到破壞；

（4）樣品做到現(xiàn)處理現(xiàn)測；短期存放置于4 ℃冷藏，存放時長不可超過8 h；

（5）輕柔顛倒離心管混勻樣品，嚴(yán)禁劇烈震蕩產(chǎn)生大量氣泡。

4.預(yù)實(shí)驗(yàn)基線驗(yàn)證

空白乳酸菌培養(yǎng)基上機(jī)開展90 min動態(tài)張力檢測，確認(rèn)空白培養(yǎng)基表面張力穩(wěn)定，營養(yǎng)基質(zhì)不會降低水溶液界面張力；取發(fā)酵中后期上清預(yù)測試，確認(rèn)探針潤濕正常，儀器可以捕捉脂肽引發(fā)的表面張力下降。

三、標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)檢測完整操作流程

1.Kibron?Epsilon單通道精細(xì)動態(tài)張力檢測

1. 使用移液槍吸取150 μL脫氣恒溫后的發(fā)酵上清，沿著石英樣品杯內(nèi)壁緩慢加注，液面不能夾帶氣泡，出現(xiàn)氣泡則重新制備待測樣品；

2. 將樣品杯放置帕爾貼恒溫基座，關(guān)閉防風(fēng)防護(hù)罩靜置10 min，氣?液界面、液相溫度達(dá)到平衡；

3. 開啟動態(tài)表面張力采集程序，采集時長設(shè)置90 min，實(shí)時記錄完整的張力?時間吸附曲線，保存吸附誘導(dǎo)時長、張力下降速率、飽和平衡表面張力；如需測試脂肽乳化能力可繼續(xù)測定油水界面張力；

4. 樣品檢測結(jié)束之后升起金屬探針，火焰灼燒清除探針吸附的脂肽、黏性代謝產(chǎn)物；倒掉廢液，樣品杯清洗晾干之后檢測下一個時間節(jié)點(diǎn)樣品。

2.Delta?8高通量時序樣品篩查

各個時間梯度發(fā)酵上清依次添加進(jìn)96孔低吸附微孔板，單孔添加50 μL上清；微孔板加蓋之后恒溫靜置平衡30 min；

啟動儀器自動序列檢測程序，每個微孔重復(fù)檢測三次取平均值；每隔10個樣品放置空白培養(yǎng)基對照孔，實(shí)時監(jiān)控基線漂移。

3.平行樣品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

同一個取樣時間點(diǎn)三份平行發(fā)酵上清測得平衡表面張力差值大于0.5 mN/m，樣品重新離心、脫氣復(fù)測；全部時序樣品檢測溫度、界面靜置時長、探針下落參數(shù)保持統(tǒng)一，保證整條發(fā)酵動力學(xué)曲線數(shù)據(jù)具備可比性。

4.實(shí)驗(yàn)收尾以及儀器養(yǎng)護(hù)

全部周期樣品檢測完畢之后反復(fù)灼燒探針，清理脂肽殘留物；樣品容器熱水浸泡，乙醇擦拭沖洗晾干。導(dǎo)出每一個取樣時刻動態(tài)張力曲線、各項(xiàng)動力學(xué)參數(shù)；同步對應(yīng)記錄菌體OD、發(fā)酵液pH；探針放置干燥防塵環(huán)境存放。

四、數(shù)據(jù)處理與發(fā)酵周期動態(tài)張力結(jié)果解析

1.提取關(guān)鍵界面動力學(xué)參數(shù)

提取吸附誘導(dǎo)時間、表面張力下降速率、平衡氣?液表面張力、油水界面張力；以發(fā)酵時長作為橫坐標(biāo)，平衡表面張力為縱坐標(biāo)繪制脂肽分泌動力學(xué)曲線。

2.結(jié)合乳酸菌生長階段解讀脂肽合成規(guī)律

1. 延滯期：乳酸菌適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，菌體幾乎沒有增殖，脂肽分泌量極低，發(fā)酵上清表面張力和空白組基本一致；

2. 對數(shù)生長期：乳酸菌快速增殖代謝，開始大量合成分泌脂肽，動態(tài)表面張力快速下降，分子界面吸附速率持續(xù)升高；

3. 穩(wěn)定期：菌體生物量到達(dá)峰值，脂肽持續(xù)累積至臨界膠束濃度，平衡表面張力下降至最低數(shù)值并短期維持；

4. 衰亡期：乳酸菌菌體裂解，胞外酶分解消耗脂肽，發(fā)酵上清界面張力逐步回升。

3.發(fā)酵工藝確定

根據(jù)張力最低點(diǎn)對應(yīng)的發(fā)酵時長確定脂肽最佳采收時間；對照不同溫度、pH、碳氮源實(shí)驗(yàn)組的動態(tài)張力曲線，優(yōu)化乳酸菌脂肽發(fā)酵條件。

五、關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)控制要點(diǎn)

1.疏水脂肽極易附著金屬探針，每一次樣品檢測結(jié)束都要灼燒清潔探針；檢測順序按照取樣由早到晚開展，規(guī)避高濃度脂肽殘留污染早期低活性發(fā)酵上清；

2.全程檢測溫度固定為發(fā)酵溫度，溫度變化會改變脂肽單體擴(kuò)散速率、膠束粒徑，造成動態(tài)吸附曲線出現(xiàn)偏差；

3.所有平行搖瓶的培養(yǎng)基、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、溫度條件保持一致；

4.發(fā)酵上清禁止劇烈搖晃，提前產(chǎn)生的氣泡會消耗氣?液界面脂肽單體，使吸附動力學(xué)曲線失真；

5.上清清澈透亮則省略過濾步驟，防止疏水脂肽被濾膜吸附損失；

6.檢測期間防風(fēng)罩全程閉合，空氣流動擾動氣?液界面，會干擾動態(tài)表面張力監(jiān)測結(jié)果。