一、實驗目的
1. 依托芬蘭Kibron Delta-8八通道高通量表面張力分析儀，建立批量、標準化的生物類似藥蛋白動態表面張力檢測方法，通過界面吸附動力學曲線評價單抗、融合蛋白等生物類似藥在氣液界面的吸附、構象舒展與界面誘導聚集傾向。
2. 批量篩選緩沖體系pH、離子強度、保護輔料、防腐劑、蛋白濃度等變量對蛋白界面穩定性的影響，快速區分候選處方之間的穩定性差異。
3. 建立張力曲線特征與蛋白界面聚集風險的對應判定規則，預判生產攪拌、過濾、灌裝、凍融等工藝過程中蛋白變性、顆粒產生風險，為生物類似藥處方開發、工藝穩健性評估、與原研藥界面行為一致性比對提供量化依據。
二、實驗前期準備
1. 儀器與耗材準備
儀器主體為芬蘭Kibron Delta-8高通量動態表面張力儀，配套八通道DyneProbe探針組、探針高溫自動清潔模塊、恒溫控制系統、配套數據分析軟件、96孔DynePlate聚丙烯微孔測試板。
輔助耗材包括18.2 MΩ·cm超純水、各類藥用緩沖鹽、甘露醇、海藻糖、組氨酸、吐溫20等保護輔料、待測生物類似藥原液、原研參比品、0.22 μm低蛋白吸附水系濾器、無菌離心管、多通道移液槍、無粉乳膠手套、無水乙醇。
探針預處理：設備開機后啟動全自動高溫灼燒清潔程序，對8根探針同步高溫除雜，去除上一輪殘留蛋白與有機物，冷卻完成后儀器自動歸位。單次整板測試結束必須再次執行探針整體清潔，避免通道交叉污染。
儀器環境與參數設定：儀器放置于減震大理石臺面，遠離離心機、振蕩器、空調直吹氣流，整機通電預熱30 min，設置實驗溫度25±0.5 ℃，模擬室溫工藝條件；如需模擬體內溫度可設置37 ℃。啟動軟件完成通道自檢、位移校準、張力傳感器零點校驗，確認8個通道平行性誤差小于0.2 mN/m。
微孔板預處理：96孔板使用超純水輕柔沖洗，自然晾干，避免塑料析出物影響界面測量，全程禁止手觸碰板底與孔內液面接觸區域。
2. 溶液體系配制與樣品分組設計
基礎緩沖液配制：按照生物藥常用處方分別配制磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液，梯度調節pH值與氯化鈉離子強度，全部經0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣30 min徹底去除溶解氣泡，室溫靜置備用。
蛋白工作液配制：生物類似藥原液輕柔顛倒混勻，禁止劇烈渦旋產生預聚集；若存在微量亞可見顆粒，采用低速短時離心取上清，再經低蛋白吸附濾器過濾除去本體預聚體。使用不同緩沖液梯度稀釋為統一蛋白濃度工作液，現配現測，全程避光、低溫暫存。
變量梯度實驗組設置
第一組，緩沖環境變量：不同pH梯度、不同離子強度梯度體系；
第二組，保護輔料變量：不同濃度吐溫20、海藻糖、甘露醇、精氨酸等穩定劑梯度添加；
第三組，濃度變量：不同蛋白質量濃度梯度；
第四組，參比對照：原研藥同等條件稀釋液、空白緩沖液、強制氧化/攪拌脅迫高聚集陽性對照。
所有實驗組僅保留單一變量，溶劑滲透壓、助溶劑終濃度保持完全一致，消除體系背景干擾。
3. 基線校準與空白質控驗證
在96孔板預留空白緩沖孔，加入脫氣后的空白緩沖液，將微孔板卡入儀器載板，執行基線采集。
連續采集空白緩沖液動態表面張力30 min，單通道數值波動小于0.2 mN/m判定基線穩定，8個通道之間張力差值均勻無明顯偏差，方可正式上樣檢測。
記錄空白緩沖液平衡表面張力作為本底，后續所有樣品數據均以此為扣除基準。每測試3塊微孔板插入一板空白板復測，監控儀器長時間運行基線漂移。
三、高通量完整上機操作流程
1. 96孔板標準化加樣操作
每孔統一加入50 μL蛋白待測工作液，使用多通道移液槍勻速加樣，沿孔壁緩慢注入，避免沖擊液面產生微小氣泡，孔內出現氣泡直接作廢重新加樣。
按照預先排版排布待測樣品、技術復孔、各類對照組，同一變量梯度連續排布，方便后續批量對比。加樣完成后使用透明封板膜輕輕密封微孔板，室溫避光靜置20 min，使蛋白分子在液相中分布均勻，減少移液擾動帶來的初始界面行為異常。
小心揭除封板膜，再次檢查孔內氣泡，確認無氣泡后將微孔板平穩卡入Delta-8儀器卡槽，鎖定載板防止運行過程位移。
2. 動態表面張力高通量采集設置與運行
在軟件內新建高通量測試方案，選定動態表面張力時間掃描模式，設置單孔采集總時長90 min，對于界面吸附極慢的單抗樣品可延長至120 min，儀器自動逐行移動載板，八通道同步并行采集每一個孔位張力隨時間變化曲線。
設置探針浸入深度、停留時間統一參數，全程關閉儀器外防風罩，隔絕環境氣流擾動。整塊板自動測量完成后，軟件自動保存全部原始曲線數據。
同一批次所有實驗組至少設置2塊獨立配制的微孔板平行測試，出現穩定性異常的處方單獨復測驗證結果可靠性。
3. 板間防污染與儀器階段性維護
每一塊微孔板測試完畢，立即啟動探針全自動高溫灼燒清洗程序，徹底去除不可逆吸附在金屬探針表面的蛋白分子，避免高聚集樣品污染后續低聚集樣品。
不同風險等級樣品遵循先低聚集新鮮樣品、后脅迫處理高聚集樣品的測試順序，最大程度降低交叉吸附干擾。單日全部實驗結束后，執行一次整機深度校準，記錄環境溫濕度與設備運行狀態。
四、數據處理、穩定性判定標準與處方篩選規則
1. 數據導出與核心參數提取
從配套分析軟件批量導出所有孔位動態表面張力-時間原始曲線，批量提取四項關鍵指標：張力誘導期時長、表面張力下降速率、吸附平衡表面張力、平臺期曲線穩定性。
匯總平行樣品數據計算平均值，將曲線特征與蛋白界面穩定性直接對應，建立批量處方篩選數據表。
2. 蛋白界面穩定性等級判定規則
一級，界面穩定性優異（低聚集風險，可作為優選處方）
動態張力誘導期較短，張力快速陡峭下降，短時間內進入平穩平臺區，平衡張力長期無漂移。代表蛋白分子僅發生可逆界面吸附，構象舒展程度低，分子間幾乎不發生疏水交聯與二硫鍵錯配，在攪拌、灌裝工藝中不易產生界面誘導顆粒，可與原研藥界面行為高度匹配。
二級，界面穩定性一般（中等聚集風險，需優化處方）
張力誘導期明顯拉長，下降速率平緩緩慢，平臺期曲線存在緩慢向下小幅漂移。說明蛋白在界面逐步發生構象改變，二維界面緩慢形成蛋白寡聚體，長期放置或多次工藝循環后聚集體脫落進入本體溶液，存在亞可見顆粒超標風險，需要優化緩沖pH或補充穩定劑。
三級，界面穩定性差（高聚集風險，直接淘汰處方）
整體張力下降幅度微弱，長時間無法達到穩定平臺，曲線不規則震蕩波動；或是短暫下降后張力反向回升。代表蛋白在氣液界面發生不可逆變性、大量堆疊形成界面蛋白膜，膜結構坍塌脫落，極易出現肉眼可見絮狀物、顆粒，生物類似藥質量不達標，直接排除該處方。
同時可對比添加穩定劑前后曲線變化，若加入吐溫、氨基酸后曲線恢復為穩定單體特征，直接量化輔料對蛋白界面的保護效果。
3. 高通量篩選應用要點
利用Delta-8八通道高通量能力，單次可完成上百組緩沖、輔料、濃度變量初篩，僅對篩選出的少量穩定處方開展SEC-HPLC粒徑排阻色譜、DLS粒徑檢測、濁度測定進行二次驗證，極大縮減生物類似藥處方研發周期。
長期穩定性留樣考察中，按月度復測同一處方動態張力曲線，若平衡張力明顯升高、曲線形態劣變，可提前預警儲存過程蛋白構象穩定性下降。
通過張力曲線相似度比對，可完成生物類似藥與原研藥界面行為一致性評價，支持藥學一致性評價資料撰寫。
五、實驗注意事項
1. 生物類似藥蛋白極易受機械剪切影響，取樣、稀釋、加樣全程動作輕柔，嚴禁劇烈吹打、渦旋，避免預先產生界面變性，導致張力測試結果失真。
2. 所有待測溶液必須充分超聲脫氣，微孔內微小氣泡會造成張力曲線無序波動，無法真實反映蛋白界面吸附行為。
3. 探針高溫清潔步驟不可省略，蛋白大分子在金屬表面吸附能力極強，殘留污染會造成后續所有樣品數據系統性偏差。
4. 全批次實驗溫度、加樣體積、采集時長、探針浸入參數完全統一，僅設置單一變量，保證不同組別數據具備統計學可比性。
5. 實驗環境嚴格杜絕震動、空調直吹微孔板，微量液體水分蒸發會造成蛋白濃度升高，改變界面吸附動力學。
6. 高通量張力篩選僅為界面穩定性體外間接評價手段，最終處方必須結合強制降解試驗、長期穩定性留樣、體內藥效學試驗綜合確認。
