一、實驗目的
建立基于芬蘭Kibron表面張力分析儀動態張力曲線的蛋白藥物界面聚集行為定量檢測方案，通過動態表面張力隨時間變化的曲線特征，直觀判定蛋白在氣液界面的吸附速率、構象展開程度與界面聚集等級，用于單抗、重組蛋白、多肽類藥物制劑穩定性評價，預判攪拌、灌裝、凍融過程中界面誘導蛋白聚集風險，同時篩選可抑制界面聚集的處方輔料與緩沖體系。
二、實驗前期準備
1. 儀器與耗材準備
選用芬蘭Kibron系列表面張力分析儀，單通道機型采用Epsilon型號，高通量批量篩選選用Delta-8八通道機型，配套DyneProbe金屬威爾helmy探針、溫控模塊、張力數據采集軟件、石英微量樣品杯或96孔DynePlate微孔板。輔助耗材包含18.2 MΩ·cm超純水、0.22 μm水系無菌濾膜、無菌離心管、微量移液槍、無水乙醇、氮氣吹掃瓶、無粉乳膠手套。
探針預處理：每次測試前使用丁烷火焰充分灼燒DyneProbe探針，徹底去除吸附的蛋白殘留與有機物，自然冷卻至室溫后卡入張力傳感器固定位。高通量Delta-8機型每塊微孔板測試完成后啟動儀器自動高溫清潔程序，防止通道交叉污染。
儀器環境與參數預設：將設備放置在減震臺面，遠離空調直吹風、離心機震動干擾源，開機預熱30分鐘，設定實驗溫度25±0.5 ℃，蛋白藥物模擬體內環境可調整至37 ℃。啟動采集軟件完成硬件自檢，確認探針升降位移、張力信號采集無異常。所有樣品杯或微孔板依次用乙醇、超純水沖洗，氮氣吹干備用，禁止手部觸碰液體接觸內壁。
2. 蛋白樣品與緩沖液配制
基礎緩沖液配制：按照蛋白藥物處方體系配制緩沖液，常用磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液，精準調節目標pH值，配制后經0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣30分鐘去除溶解氣泡，靜置冷卻至室溫。
待測蛋白工作液配制：原液蛋白溶液輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩預先引入界面聚集；存在微量可見顆粒的樣品先低速離心取上清液，再用0.22 μm低蛋白吸附濾器過濾，去除本體預聚體干擾。根據實驗梯度，用脫氣緩沖液稀釋成不同蛋白濃度工作液，現配現測，全程避光低溫暫存。
對照組溶液設置：空白緩沖液對照組（僅緩沖體系）、未強制應力處理的新鮮蛋白單體對照組、攪拌/高溫脅迫誘導的高聚集陽性對照組、添加吐溫等保護輔料的制劑對照組，所有對照組溶劑體系、滲透壓完全保持一致。
3. 基線校準與空白體系驗證
向樣品杯或微孔中加入脫氣空白緩沖液，放置于溫控平臺，等待溫度穩定，探針完全浸潤液相后靜置平衡20分鐘，在軟件執行基線歸零操作。
連續記錄空白緩沖液表面張力30分鐘，若數值波動小于0.2 mN/m，判定基線穩定；波動超標則重新清潔探針與容器、更換脫氣緩沖液。記錄空白緩沖液平衡表面張力數值，作為后續所有樣品的本底參照標準。隨機選取點位重復測量3次，驗證通道平行性，通道間張力差值穩定后方可正式上樣。
三、動態張力完整上機操作流程
1. 樣品加樣與體系靜置平衡
單通道微量杯操作：向潔凈樣品杯中加入150–200 μL蛋白待測液，動作平緩沿杯壁加注，避免產生大量微小氣泡，液面無氣泡方可繼續實驗。將樣品杯平穩卡入儀器溫控臺，靜置5分鐘消除移液擾動，等待液面相態完全穩定。
高通量96孔板操作：每孔統一加入50 μL蛋白工作液，按照預設排布放置待測樣品、各類對照組與復孔，加樣完畢輕封封板膜避光靜置30分鐘，保證蛋白分子在本體溶液中分布均勻，揭膜后檢查孔內氣泡，含氣泡孔作廢重新加樣。將微孔板水平卡入儀器載板卡槽，確認卡位牢固不晃動。
2. 動態表面張力連續采集設置
在采集軟件新建測試方案，選擇時間依賴性動態張力采集模式，設置總采集時長120分鐘，對于界面聚集緩慢的抗體類蛋白可延長至180分鐘，軟件自動連續記錄表面張力隨時間變化曲線。
單通道模式手動調整探針下降至剛好接觸氣液界面，啟動程序自動采集；Delta-8高通量模式設置逐行掃描順序，八通道同步并行測量，整塊板自動完成數據采集。
程序運行期間全程關閉儀器防風罩，杜絕氣流擾動液面造成曲線漂移。單一樣品至少獨立重復測試3次平行實驗。
3. 樣品更換與防污染操作
單通道每完成一組蛋白樣品測試，升起探針再次火焰灼燒清潔，倒掉廢液，樣品杯經乙醇浸泡、純水沖洗、氮氣吹干后再測試下一個樣品。不同聚集程度、不同處方蛋白樣品分批測試，先測低聚集新鮮單體樣品，后測高聚集脅迫樣品，減少大分子蛋白在探針表面不可逆吸附殘留。
高通量機型每測試完成一塊微孔板，自動執行探針高溫清潔程序，再放入下一塊待測板，不同批次板之間插入空白緩沖孔復測，監控儀器基線漂移。
四、數據處理、曲線特征與聚集程度判定標準
1. 原始數據提取與整理
從Kibron配套軟件導出動態表面張力-時間原始曲線，提取四項核心判定參數：誘導期時長、張力下降速率、最終平衡表面張力、平臺期曲線穩定性。匯總平行樣品數據，計算平均值用于橫向對比不同樣品聚集差異。
2. 張力曲線對應蛋白界面聚集等級判定規則
一級，低界面聚集風險（新鮮單體蛋白）：曲線誘導期短，表面張力快速大幅下降，下降斜率陡峭，較短時間內進入平穩平臺期，平衡表面張力數值偏低且長期保持穩定。說明蛋白單體擴散至界面速度快，界面僅發生可逆吸附與輕微構象舒展，分子間交聯少，不易形成界面聚集體，制劑攪拌、灌裝過程穩定性較好。
二級，中度界面聚集風險：張力下降前期速率偏慢，誘導期明顯拉長，緩慢下降階段持續時間久，平臺期存在小幅緩慢向下漂移。代表蛋白在界面逐步發生分子間疏水相互作用、二硫鍵交聯，緩慢形成二維界面蛋白凝膠層，長時間放置后會脫落進入本體溶液產生亞可見顆粒，屬于需要處方優化的中等風險樣品。
三級，高界面聚集風險（大量界面聚集）：整體張力下降幅度微弱，長時間無法達到穩定平臺，曲線持續不規則波動；或是前期短暫下降后出現張力小幅回升。該特征說明蛋白大量在界面發生不可逆構象變性、堆疊形成致密聚集體，界面吸附膜結構坍塌，是典型的界面誘導強聚集行為，在生產工藝中極易產生蛋白顆粒、絮狀物，存在免疫原性風險。
對比添加表面活性劑保護劑的組別，若張力曲線恢復為單體蛋白特征，可直接驗證輔料抑制界面聚集的效果。
3. 實驗全程質控關鍵要點
所有蛋白溶液必須充分脫氣，溶解氣體造成液面微擾動會直接扭曲動態張力曲線形態，導致聚集程度誤判。
實驗環境禁止有機溶劑揮發、風扇直吹，微量液體水分蒸發會提升蛋白濃度，改變吸附動力學行為。
蛋白大分子極易不可逆吸附在金屬探針表面，樣品之間必須嚴格執行灼燒清潔步驟，避免交叉污染導致曲線失真。
不同組別測試時，溫度、樣品體積、探針浸入深度、采集時長全部保持統一，保證多批次數據具備可比性。
脅迫處理后的高聚集蛋白樣品避免反復凍融，防止本體聚集程度進一步改變，影響界面行為對應關系。
五、實驗注意事項
1. 蛋白樣品移液、加注全程輕柔操作，不得劇烈渦旋、吹打產生大量泡沫，泡沫會預先造成蛋白界面變性，干擾真實界面聚集測試結果。
2. 濾膜選用低蛋白吸附材質，過濾步驟不可省略，本體預先存在的聚集體會降低擴散速率，改變張力曲線下降趨勢，無法真實反映界面誘導聚集能力。
3. 超微量動態張力測量對震動極度敏感，實驗過程中臺面禁止放置運行中的離心機、振蕩器，人員不要在儀器周邊頻繁走動。
4. 若需要長期跟蹤蛋白儲存過程聚集變化，需固定取樣時間點，所有測試參數完全復刻初始條件，確保前后曲線可對比。
5. 張力曲線僅作為界面聚集傾向性初篩結果，高風險樣品后續可結合SEC-HPLC粒徑排阻色譜、DLS粒度檢測進行聚集物定量驗證。
6. 實驗結束后探針、樣品杯徹底清洗烘干，長期殘留蛋白會造成后續所有基線偏移，影響后續其他樣品測試精度。
